Secuenciación convencional (Sanger)

Conocimientos previos

ADN
Replicación del ADN
Extracción de ADN
PCR
Electroforesis
Descripción

La secuenciación del  ADN es un conjunto de métodos y técnicas bioquímicas que permiten conocer el orden de los nucleótidos de un fragmento de ADN provenientes de una PCR. El método más usado para la secuenciación de fragmentos de ADN es el “tipo Sanger”, también llamado de terminación de cadena dideoxi.

Para llevar a cabo este método es necesario utilizar una polimerasa de ADN y nucleótidos modificados (ddNTPs con marca fluorescente ) para producir cadenas de ADN de diferentes longitudes. La característica principal de este método es que cuando se está duplicando la cadena de ADN y se van colocando los dNTPs y los ddNTPs, estos últimos no permiten que se forme el enlace entre un nucleótido y el siguiente durante la elongación de la cadena de ADN. El resultado de estas reacciones es un número de fragmentos de ADN de longitud variable, los cuales posteriormente son separados por tamaño utilizando electroforesis (ver Método electroforesis) a través de una fibra capilar. Este procedimiento es lo suficientemente sensible para distinguir fragmentos de ADN que difieren en tamaño por un sólo nucleótido. Después de obtener la secuencia de un fragmento de ADN se pueden identificar, analizar y estudiar los procesos biológicos básicos con los que puede estar relacionado. En la investigación biomédica, una de sus aplicaciones es para conocer las variaciones genéticas en la secuencia de un fragmento de ADN o un gen ( gene ) específico de un individuo; esto es esencial para realizar un diagnóstico o un tratamiento.
Entrada/Muestra

ADN molde: es un fragmento purificado de ADN proveniente del método de PCR.

Iniciador o “Primer”: en este método sólo se usa una secuencia de nucleótidos que se ubican en uno de los extremos del ADN molde (véase también Método de PCR).

ddNTPs marcados: nucleótidos marcados con diferentes colores fluorescentes para poder distinguir unos de otros.

Polimerasa: proteína que duplica el ADN deseado. Inicia el proceso de duplicación donde se ubica el iniciador; posteriormente la polimerasa avanza y agrega un ddNTP marcado al ADN molde para obtener  ADN con un nucleótido marcado.

Secuenciador: equipo que separa e identifica secuencias de ADN de manera automatizada.
Recursos/Material

ADN molde: es un fragmento purificado de ADN proveniente del método de PCR.

Iniciador o “Primer”: en este método sólo se usa una secuencia de nucleótidos que se ubican en uno de los extremos del ADN molde (véase también Método de PCR).

ddNTPs marcados: nucleótidos marcados con diferentes colores fluorescentes para poder distinguir unos de otros.

Polimerasa: proteína que duplica el ADN deseado. Inicia el proceso de duplicación donde se ubica el iniciador y posteriormente la polimerasa avanza y agrega un ddNTP marcado al ADN molde para obtener  ADN con un nucleótido marcado.

Secuenciador: equipo que separa e identifica secuencias de ADN de manera automatizada.
Requisitos previos

Método: Purificación de banda de un producto de PCR.
Procedimiento

Marcaje: el marcaje se lleva a cabo mediante ciclos de PCR, en los cuales se van agregando los nucleótidos (marcados y no marcados). Conforme se completan estos ciclos, se generan diferentes tamaños de un fragmento de ADN.

Electroforesis capilar: Después del marcaje se obtienen diferentes tamaños de cadenas de ADN, los cuales tienen en el último nucleótido una marca fluorescente. Estos fragmentos, al ser separados mediante esta técnica, permiten ordenar las secuencias de nucleótidos de los fragmentos de ADN desde el más pequeño hasta el más grande (ej. ATC, ATCG, ATCGG, ATCGGT,…). Mediante un dispositivo se detectan los nucleótidos marcados y así se conoce la secuencia del ADN molde (CGGT…).

Cromatograma: es el resultado gráfico de la electroforesis capilar. Se observan diferentes picos de colores, donde cada color corresponde a un nucleótido. El conjunto de estos picos ordenados corresponde a la secuencia de un fragmento de ADN.
Salida/Resultado

Un archivo computacional el cual se observa un gráfico (cromatograma) de la secuencia de nucleótidos provenientes de un fragmento de ADN.
Fuentes de error más frecuentes

Errores en la purificación del ADN

Baja concentración de ADN

Alta concentración de sales

Diseño erróneo de iniciadores

Errores comunes en las técnicas de biología molecular
Métodos alternativos

Secuenciación alelo-específica por bisulfito

Pirosecuenciación

Secuenciación masiva de alto rendimiento
Aplicaciones

Genotipificación o genotipado

Filogenia

Ancestría
Temas relacionados

Secuenciación de alto rendimiento

PCR

Filogenética

Evolución molecular

Diagnóstico clínico